O ensaio MTT (dimethylthiazol ou dphenyltetrazolium bromide) é um ensaio colorimétrico específico para a viabilidade celular, e é usado em ensaios de citotoxicidade. Nas células viáveis, o MTT reage com as desidrogenases mitocondriais, e é convertido em cristais de formazan. Esta transformação leva a que o MTT mude a sua cor, inicialmente amarela, para roxo ou púrpura (ver figura abaixo)e que se formem os cristais que são visíveis ao microscópio. Quanto mais células vivas existirem mais escura ficará esta cor. O número de células a semear em cada poço varia consoante a linhagem, mas estabelece-se que o ideal é entre 5.000 a 20.000 células/poço. Existem vários kits de MTT, mas em geral existem formas de otimizar este ensaio.
A preparação da solução de MTT:
Uma vez que o MTT é fotosensível, pode preparar-se a solução na câmara de fluxo laminar (câmara de segurança biológica) com pouca luz ou com a luz apagada. O falcon onde o MTT é preparado deve ser embrulhado com papel de alumínio e reservado a 4ºc (no frigorífico), ficando a repousar durante 24h antes de se proceder ao ensaio.
O ensaio MTT
A orla da placa em branco ou com água:
Usando uma placa de 96 poços para o ensaio MTT, deve ter-se em atenção que apenas 60 poços serão considerados a nossa área útil, uma vez que a orla (poços da periferia) da placa não deve ser usada. Isto relaciona-se com a proximidade aos extremos da tampa onde existirá sempre uma interferência dos gases externos, seja na incubadora de CO2 assim como na própria câmara de fluxo laminar.
Troca de meio:
Uma forma de otimizar o ensaio, é retirando o meio onde as células aderentes estiveram nas últimas horas ou dias. Este meio está carregado de metabolitos e proteínas que irão interferir com a leitura da placa. Deve por isso proceder-se à adição 100uL de novo meio (aditivado com 10% de FBS e 1% antibióticos) antes de adicionar a solução de MTT. A quantidade da solução de MTT será de acordo com o kit do fabricante (normalmente entre 10 a 50uL). Não esquecer que a ressuspensão com micropipeta é muito importante para existir uma homogeneização da solução de MTT com o meio.
Adicionar DMSO ou N HCl:
Após ~4horas, é necessário parar a reação do MTT com as mitocôndrias das células vivas e dissolver os cristais de formazan (para não interferir na leitura da placa. Para isto pode utilizar-se DMSO (dimetil sulfato) ou N HCL (ácido clorídrico). Sendo um ácido forte, o HCL aumenta a concentração de iões de hidrogénio, aumentando a concentração da base conjugada, o que desloca o equilíbrio da reação para a esquerda e diminui a quantidade de cristais de formazan e a reação do MTT. O DMSO é, no entanto, mais eficaz, porque provoca uma dissolução mais eficaz dos cristais de formazan. Em caso de dificuldade na escolha, deve optar-se por DMSO, que otimiza bastante a qualidade da leitura da placa.
Retirar toda a solução antes de adicionar o DMSO:
Antes de adicionar o DMSO, e independentemente do que estiver indicado no kit, deve retirar-se toda a solução de MTT com o meio de cultura. só após este passo é que se adiciona o DMSO, ressuspendendo gentilmente com a micropipeta. Os poços onde as células morreram ou os poços de controlo sem células não mudam de cor na ressuspensão, mas os poços com células viáveis mudam para cor púrpura. Quanto mais escura for a cor, maior a quantidade de células viáveis no poço.
Ler a placa a dois comprimentos de onda, 570 e 630nm:
Embora alguns autores optem por ler a placa a 570nm, a verdade é que o formazan continua a sua absorvância até aos 630nm enquanto o que causa interferência (os restos de DMEM com MTT) acabam por desaparecer num comprimento de onda acima os 610nm. Deve por isso ler-se a placa nos dois comprimentos de onda, de forma a otimizar o ensaio.
Referências:
Ghasemi M, Turnbull T, Sebastian S, Kempson I. The MTT Assay: Utility, Limitations, Pitfalls, and Interpretation in Bulk and Single-Cell Analysis. Int J Mol Sci. 2021 Nov 26;22(23):12827. doi: 10.3390/ijms222312827. PMID: 34884632; PMCID: PMC8657538.
Luis C, Castaño-Guerrero Y, Soares R, Sales G, Fernandes R. Avoiding the Interference of Doxorubicin with MTT Measurements on the MCF-7 Breast Cancer Cell Line. Methods Protoc. 2019 Apr 12;2(2):29. doi: 10.3390/mps2020029. PMID: 31164609; PMCID: PMC6632110.