As células a ser criopreservadas devem estar em passagens iniciais, entre a 4ª e a 9ª passagem (P4 a P9) (idealmente de P5 a P7), devido à preservação das características genéticas e funcionais ainda estáveis. As células devem estar em fase logarítmica (log phase) com uma confluência ~80%.
O número de células aderentes a criopreservar deve ser de ser de 1×106 até 5×106 por mL de solução no cryovial, de células em suspensão deve ser de 5×106 a 10×106 por mL e de células estaminais deve ser de 1×106 a 2×106.
Pode usar-se Glicerol ou DMSO, sendo o DMSO o gold standard para a maioria das linhas celulares e o glicerol usado em linhas em que o DMSO pode induzir diferenciação.
Existem 3 métodos aconselhados para a criopreservação, que devem ser escolhidos conforme a sensibilidade das células e a experiência do técnico:
| 1 | 2 | 3 | |
| DMEM incompleto | – | 70% | 70% |
| FBS | 90% | 25% | 20% |
| DMSO ou glicerol | 10% | 5% | 10% |
Protocolo (aqui apresentado em fluxograma):
Se os cryovials forem para a -80ºC deve usar-se o Mr. Frosty ou o CoolCell. Este é o método mais usado nos laboratórios Universitários, mas o ideal é a criopreservação em azoto (nitrogénio) liquido.
Referências:
National Center for Biotechnology Information, “Cryopreservation: A Review Article,” PMC, Nov. 16, 2022. [Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9756256/.
Sigma-Aldrich, “Cryopreservation of Cell Lines,” Sigma-Aldrich Technical Protocol, Apr. 15, 2022. [Online]. Available: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/mammalian-cell-culture/cryopreservation-of-cell-lines.
D. Smith and M. Ryan, “Implementing Best Practices and Validation of Cryopreservation Techniques for Microorganisms,” CABI Working Papers, 2012. [Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3353557/.