Quando estamos perante uma cultura de células que não cresce, ou seja, as células não proliferam, e tendo em conta que o meio está devidamente aditivado, temos de tomar algumas medidas, e uma delas é suplementar o meio.
O tipo de meio
A relação entre a quantidade de glucose do meio e o crescimento celular depende essencialmente da linhagem celular com que se trabalha. Por isso, fazer uma troca de meio DMEM low glucose para um DMEM high glucose, com a ilusão de que as células vão crescer mais depressa, pode não ser adequado. Deve sempre ver-se o protocolo e meio aconselhado para cada linhagem celular (dado pelo fornecedor nas linhas imortalizadas)m
O Soro Fetal Bovino (FBS)
O soro fetal bovino ou FBS é um importante suplemento para o meio de cultura. A sua relação (exceptuando algumas linhas celular), de ser de 10% de FBS para 100% de meio completo. Quando o meio já se encontra aditivado com FBS, e a cultura cresce muito lentamente, devem considerar-se outros fatores antes de suplementar com mais FBS, uma vez que um aumento na suplementação de FBS vai aumentar o crescimento das células mas estas células podem sofrer alterações morfológicas e funcionais, devido ao facto de o FBS ser de origem animal e a sua composição ser algo indefinida e variável em lotes. Para além disso, a adição de maiores quantidades de soro fetal bovino aumenta o risco de contaminações.
L-Glutamina
Esta será a solução mais inteligente, tendo em conta as vantagens e desvantagens de cada suplemento. A glutamina é um aminoácido importante para o metabolismo celular e aumenta o crescimento na cultura de células embora, seja muito instável. Nos meios de cultura, a glutamina que já vem aditivada ao meio pode degradar-se com o tempo, sendo necessária a sua reposição se o meio já tiver algum tempo ou se as células apresentam crescimento muito lento. A adição deve ser cuidadosa e o amoníaco monitorizado. Podem ser adicionados 2-6mM, mas se o crescimento estiver mesmo muito lento, opta-se por 4mM. Adiciona-se 2% de Glutamina ao volume total de DMEM. Ou seja, se tivermos um frasco de L-Glutamina de 100mL a 200mM, e quisermos aditivar 4mM a um frasco de 500mL de DMEM, são 10mL de glutamina.
Contaminações
É um dos motivos para as células não crescerem, e no caso das células aderentes, estas aderem com dificuldade ao T-Flask ou não aderem de todo. Ao microscópio vêem-se pontinhos ou filamentos que não pertencem à nossa cultura celular. Antes de iniciar a cultura, o meio deve estar aditivado com 1% de estreptomicina/penicilina, ou outro antibiótico. Em caso de suspeita pode ainda usar-se um antimicótico ou antifúngico, onde normalmente a escolha recai na Anfotericina B ou Fungizona (2,5mg/L) a 1% do volume total de DMEM.
Também se pode adicionar a Anfotericina a 1% ao tabuleiro de água da incubadora de CO2. Outros produtos também adequados para este fim são, Aquaguard-1, FroggaClean-1 e Lysol no rinse.
Referências
R. I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th ed. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell, 2010.
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